CAR-T療法正在改變腫瘤治療的前景，但其生產(chǎn)本身也面臨一系列挑戰(zhàn)。與大多數(shù)藥物不同，由于CAR-T療法使用患者自己的T細(xì)胞，是高度個(gè)性化的，細(xì)胞治療產(chǎn)品的質(zhì)量在批次和患者之間存在顯著差異。在開發(fā)過程中，最重大的挑戰(zhàn)之一是表征制備CAR-T產(chǎn)品的質(zhì)量和效力。IsoPlexis單細(xì)胞蛋白組學(xué)技術(shù)幫助研究者很好的迎接這方面的挑戰(zhàn)。

IsoPlexis技術(shù)評(píng)價(jià)單細(xì)胞的多功能性，根據(jù)其功能定義細(xì)胞的質(zhì)量

IsoPlexis系統(tǒng)檢測(cè)每個(gè)單個(gè)細(xì)胞分泌的特定細(xì)胞因子，并識(shí)別多功能細(xì)胞和細(xì)胞亞群（那些細(xì)胞分泌兩個(gè)或更多細(xì)胞因子），這些亞群在多種研究和疾病治療相關(guān)。IsoPlexis平臺(tái)還可以在表型相同的樣本中檢測(cè)到細(xì)胞功能異質(zhì)性，這些細(xì)胞及其異質(zhì)性帶來的特質(zhì)會(huì)被流式技術(shù)或群組檢測(cè)的技術(shù)忽略（圖1）。IsoLight全自動(dòng)單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞功能深度分析，文獻(xiàn)數(shù)據(jù)顯示與患者臨床結(jié)果關(guān)聯(lián)，未來可成為細(xì)胞治療產(chǎn)品的療效預(yù)判與監(jiān)控。

圖1. 表型相同的細(xì)胞，表現(xiàn)出功能的異質(zhì)性

應(yīng)用案例

在這里，我們討論了一個(gè)研究案例，研究人員使用了Miltenyi自動(dòng)化系統(tǒng)進(jìn)行上游的靶向CD19/CD22雙特異性CAR-T制備，接著使用IsoLight單細(xì)胞分析平臺(tái)進(jìn)行下游的細(xì)胞功能質(zhì)量評(píng)估。研究人員采用了兩種生產(chǎn)制備方法，對(duì)比了不同的方法制備的CAR-T細(xì)胞的差異（圖2）。第一種方法（M1）在第5天以洗滌步驟終止轉(zhuǎn)染，而第二種方法（M2）在第3天終止轉(zhuǎn)染。

復(fù)蘇的CAR-T細(xì)胞用抗CD4或抗CD8磁珠分選，并與表達(dá)CD19或CD22抗原的靶細(xì)胞共培養(yǎng)。去除靶細(xì)胞后，將CAR-T細(xì)胞懸液載入IsoCode單細(xì)胞蛋白質(zhì)組芯片，捕獲單細(xì)胞的細(xì)胞因子信號(hào)，數(shù)據(jù)使用IsoSpeak軟件進(jìn)行分析。結(jié)果表明，無論是靶向CD19還是CD22的CAR-T細(xì)胞，使用M2方法制備得到的細(xì)胞，細(xì)胞多功能指數(shù)更高(圖3上)；CD4+（左）和CD8+（右）CAR-T產(chǎn)品中，使用M2方法制備的細(xì)胞，多功能細(xì)胞的占比更高(圖3下)。即使用M2制備的CAR-T產(chǎn)品表現(xiàn)出更高的多功能性，也表現(xiàn)在效應(yīng)性因子和刺激性細(xì)胞因子的增加。這一單細(xì)胞多功能數(shù)據(jù)清楚地表明，與之前使用的M1相比，M2顯著改善了雙特異性CD19/CD22 CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的功能。

圖3. PSI和細(xì)胞多功能性是評(píng)價(jià)細(xì)胞功能的標(biāo)尺

精確的功能質(zhì)量分析在CAR-T制備的重要性

在評(píng)價(jià)CAR-T產(chǎn)品評(píng)價(jià)過程中，細(xì)胞數(shù)量和活力的增加并不總是與細(xì)胞功能的增強(qiáng)跟最終治療效果正相關(guān)。上述研究使用IsoSpeak多維生信分析軟件，細(xì)胞多功能指數(shù)(Polyfunctional Strength Index PSI)對(duì)這兩種方法進(jìn)行了評(píng)價(jià)。PSI同時(shí)涵蓋了細(xì)胞因子分泌的廣度(多功能，即分泌兩個(gè)或更多細(xì)胞因子的單個(gè)CAR-T細(xì)胞)和細(xì)胞因子分泌的強(qiáng)度（分泌量）。PSI可以作為獨(dú)特的標(biāo)尺在治療應(yīng)用之前評(píng)估細(xì)胞產(chǎn)品的效力。早在2018年一篇Blood文章中研究了治療非霍奇金淋巴瘤(NHL)靶向CD19 CAR-T細(xì)胞，檢測(cè)了在輸注前CAR-T細(xì)胞的多功能性及PSI指數(shù)，并發(fā)現(xiàn)與臨床結(jié)果有正相關(guān)性。研究表明，這些患者輸注前CAR-T的多功能性與患者接受治療后的客觀反應(yīng)(OR)和細(xì)胞因子釋放綜合征(CRS)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)正相關(guān)性，通過單細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蝾A(yù)測(cè)臨床治療結(jié)果及不良反應(yīng)。PSI可以有效區(qū)分對(duì)治療有應(yīng)答者和無應(yīng)答者。

自動(dòng)化端到端(End-to-end)工作流程的數(shù)據(jù)穩(wěn)定性

考慮到細(xì)胞治療產(chǎn)品生成跟品質(zhì)，細(xì)胞治療行業(yè)從細(xì)胞處理工作流程，細(xì)胞分離、細(xì)胞培養(yǎng)到最終細(xì)胞產(chǎn)物的配方都需要更多自動(dòng)化的流程。IsoPlexis的IsoLight單細(xì)胞因子檢測(cè)系統(tǒng)采用全自動(dòng)檢測(cè)的工作方式，包含細(xì)胞培養(yǎng)，捕獲因子信號(hào)，多重因子檢測(cè)，影像數(shù)據(jù)讀取及導(dǎo)出。簡(jiǎn)單直觀的IsoSpeak多維生信分析軟件，無需特別培訓(xùn)生信分析人員來進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。大幅提高工程細(xì)胞產(chǎn)品開發(fā)和流程的優(yōu)化。

參考文獻(xiàn)：